Las obras se comenzaron conforme al modelo gótico de la catedral de Toledo, por Enrique Egas. En 1529 las obras fueron encomendadas al arquitecto Diego de Siloé, que diseñó una nueva traza del templo de estilo renacimiento español, uniendo la planta circular con la basilical, lo que le supuso el reconocimiento de los arquitectos de la época.

Consta de cinco naves separadas por veinte enormes pilares con columnas clásicas y girola con vidrieras flamencas, obra de Teodoro de Holanda y Juan Campen. La espectacular fachada barroca, trazada por Alonso Cano es de 1667, fue concebida como un monumental arco de triunfo con casetones y tres calles retranqueadas entre pilastras cajeadas, lo que proporciona al conjunto intensos contrastes luminosos. Siloé proyectó inicialmente dos altas torres. Sin embargo, una no se llegó a realizar y la otra sólo alcanzó 57 de los 81 metros con que había sido concebida.

En el interior del templo destaca la Capilla Mayor, obra maestra de Siloé. Es redonda y elevadísima, sostenida por 12 gruesos pilares corintios, donde se encuentran las estatuas orantes de los Reyes Católicos, obra de Pedro de Mena y Madrazo. El testero principal de la sacristía lo ocupa un gran crucificado, de Martínez Montañés, y en una vitrina baja puede verse una pequeña Inmaculada, de Alonso Cano. El facistol, muy ornamentado, fue realizado por Alonso Cano. Destacar las capillas de la Virgen del Pilar, de Nuestra Señora de la Antigua, y de la Trinidad.

Junto a ella se encuentra la iglesia neoclásica del Sagrario, con una elevada cúpula del renacimiento construida por Hurtado Izquierdo, de 1705 a 1759. En el Museo catedralíceo pueden contemplarse obras maestras de pintores como Bocanegra, Risueño, Sánchez-Cotán, Raxis, Cieza, Pacheco y esculturas de Alonso y Pedro de Mena, Pablo Pacheco.